I. Modularna struktura ruchomych elementów genetycznych (MGE, ang. mobile genetic element). Genomika bakterii. Rola MGE w kształtowaniu struktury genomów bakterii. II. Integrony i superintegrony (struktura genetyczna, klasyfikacja, rola w determinowaniu oporności na antybiotyki). III. Elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable element) - ogólna charakterystyka sekwencji insercyjnych i transpozonów (klasyfikacja, rozpowszechnienie w genomach bakterii, rodzaje zmian spowodowanych transpozycją, regulacja częstości transpozycji, rola w horyzontalnym transferze genów (HGT, ang. horizontal gene transfer). Metody identyfikacji funkcjonalnych TE z zastosowaniem różnego typu wektorów pułapkowych. IV. Elementy integrujące z DNA i koniugacyjne (ICE, ang. conjugative and integrative element). V. Plazmidy bakteryjne (definicja, występowanie, nazewnictwo, klasyfikacja, struktura). (1) Identyfikacja plazmidów (metody genetyczne i fizyko-chemiczne). (2). Schemat podstawowej charakterystyki plazmidów (struktura, oznaczanie wielkości, liczby kopii, zakresu gospodarza, grupy niezgodności, mapowanie restrykcyjne). (3) Replikacja plazmidów [modele replikacji plazmidów kolistych i liniowych, pojęcia: replikon, podstawowy replikon/minimalny replikon; origin replikacji (oriV), mechanizmy regulacji inicjacji replikacji, molekularne podstawy niezgodności (inc), plazmidów]. (4) Mechanizmy zapewniające stabilne utrzymywanie plazmidów w komórkach bakteryjnych (systemy: aktywnego rozdziału, rozdziału form oligomerycznych, addykcyjne - molekularne podstawy funkcjonowania; pochodzenie). (5) Systemy transferu plazmidów (plazmidy koniugacyjne i mobilizowalne; struktura oriT (ang. origin of conjugational transfer). VI. Funkcje fenotypowe bakterii kodowane przez MGE. VII. Pochodzenie i ewolucja MGE. VIII. Rola MGE w horyzontalnym transferze genów. IX. Zastosowanie MGE w inżynierii genetycznej i biotechnologii.

Ćwiczenia:
dr hab. Łukasz Dziewit, dr Magdalena Szuplewska
- pobierz skrypt

I. Podstawowe etapy identyfikacji i analizy plazmidów bakteryjnych: (1) Oczyszczanie plazmidowego DNA przez ultrawirowanie w gradiencie CsCl+EtBr; inne metody izolacji plazmidów; wizualizacja DNA megaplazmidów. (2) Konstrukcja minireplikonów (określenie replikonów minimalnych i podstawowych); wykorzystanie wektorów wahadłowych do analizy plazmidowych systemów replikacyjnych i systemów stabilizujących. (3) Wykorzystanie plazmidów bakteryjnych w inżynierii genetycznej: (a) rodzaje wektorów; (b) izolacja fragmentów restrykcyjnych plazmidowego DNA z żelu agarozowego; (c) klonowanie genów bakteryjnych w wybranych wektorach (różne rodzaje selekcji zrekombinowanych klonów). (4) Metody wprowadzania plazmidowego DNA do komórek bakterii: transformacja chemiczna, elektroporacja, koniugacja trójrodzicielska (wpływ zakresu gospodarza, niezgodności plazmidów oraz bariery restrykcyjnej na utrzymywanie się plazmidów w różnych gospodarzach). II. Analiza systemów stabilizujących, kodujących toksynę i antytoksynę, pochodzących z różnego typu ruchomych elementów genetycznych (plazmid, bakteriofag, transpozon koniugacyjny): (1) Analiza organizacji genetycznej systemów addykcyjnych - izolacja i elektroforeza RNA oraz RT-PCR (ang. reverse transcription PCR). (2) Oznaczanie aktywności promotorów systemów addykcyjnych poprzez badanie aktywności enzymatycznej b-galaktozydazy. (3) Konstrukcja i wykorzystanie bakteryjnych układów dwuhybrydowych do badania interakcji białek kodowanych przez systemy addykcyjne. (4) Wykorzystanie wektorów ekspresyjnych do analizy funkcjonalnej systemów addykcyjnych, badanie efektu toksycznego wywołanego przez trucizny różnych systemów addykcyjnych oraz zdolności antidotum do jego odwracania. III. Identyfikacja i analiza elementów transpozycyjnych (TE): (1) Identyfikacja TE z wykorzystaniem wektorów pułapkowych. (2) Określenie liczby kopii oraz lokalizacji zidentyfikowanych TE w genomie gospodarza poprzez hybrydyzację DNA-DNA. (3) Badanie rozpowszechnienia zidentyfikowanych TE poprzez analizę hybrydyzacyjną DNA-DNA z wykorzystaniem transferu typu DOT-BLOT. VI. Bioinformatyczne metody analizy sekwencji nukleotydowych ruchomych elementów genetycznych (programy: Artemis, BLAST, CloneManager, ORF Finder).